DECRETO 16 maggio 2002 - Tenori massimi e metodiche di analisi delle biotossine algali nei molluschi bivalvi vivi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini

IL MINISTRO DELLA SALUTE Visto il decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 530, concernente attuazione della direttiva 91/492/CEE, che stabilisce norme sanitarie applicabili alla produzione e commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi; Vista la legge 20 novembre 1995, n. 490, recante conversione in legge, con modificazioni, del decreto-legge 20 settembre 1995, n.

390, concernente provvedimenti urgenti in materia di prezzi di specialita' medicinali, nonche' in materia sanitaria; Visto il decreto legislativo 15 marzo 1996, n. 249, recante modificazioni al decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 530, concernente attuazione della direttiva 91/492/CEE che stabilisce norme sanitarie applicabili alla produzione e commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi; Visto il decreto del Ministero della sanita' 31 luglio 1995 concernente metodiche di analisi per la determinazione dei coliformi fecali, di Escherichia coli, delle salmonelle, delle biotossine PSP (Paralytic Shellfish Poison), delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poison), del mercurio e del piombo nei molluschi bivalvi (pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 279 del 29 novembre 1995); Visto il decreto ministeriale 14 ottobre 1998 recante modificazioni all'allegato al decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 530, e successive modifiche, in attuazione della direttiva 97/61/CE; Vista la direttiva del Consiglio 91/492/CEE del 15 luglio 1991 che stabilisce norme sanitarie applicabili alla produzione e commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi; Vista la direttiva del Consiglio 97/61/CE del 20 ottobre 1997 che modifica l'allegato alla direttiva 91/492/CEE, che stabilisce norme sanitarie applicabili alla produzione e commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi; Vista la decisione della Commissione 2002/225/CE del 15 marzo 2002 che fissa norme specifiche per l'attuazione della direttiva 91/492/CEE del Consiglio per quanto concerne i tenori massimi e i metodi d'analisi di talune biotossine marine in molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini; Vista la decisione del Consiglio 93/383/CEE del 14 luglio 1993 in materia di laboratori di riferimento per il monitoraggio delle biotossine marine; Considerato che le decisioni sopracitate apportano modifiche tecniche alla direttiva 91/492/CEE; Visto l'art. 17 del decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 530; Visto l'art. 20 della legge 16 aprile 1987, n. 183, concernente il coordinamento delle politiche riguardanti l'appartenenza dell'Italia alle Comunita' europee e l'adeguamento dell'ordinamento interno agli atti normativi comunitari; Decreta

Art. 1.

Il presente decreto stabilisce il tenore massimo di biotossine algali del complesso DSP (acido okadaico, dinophysitossine), yessotossine, pectonotossine e azaspiracidi, nonche' i metodi d'analisi da impiegare per la determinazione delle sopracitate biotossine e delle biotossine PSP e ASP, e si applica a molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini destinati al consumo immediato o ad ulteriore lavorazione prima del consumo.

Art. 2.

Il tenore massimo complessivo di acido okadaico, dinophysitossine e pectenotossine negli animali di cui all'art. 1 (corpo intero o parti consumabili separatamente) e' fissato a 160 µg di equivalente acido okadaico/kg. I metodi d'analisi sono riportati nell'allegato.

Art. 3.

Il tenore massimo complessivo di yessotossine negli animali di cui all'art. 1 (corpo intero o parti consumabili separatamente) e' fissato a 1 mg di equivalente yessotossine/kg. I metodi d'analisi sono riportati nell'allegato.

Art. 4.

Il tenore massimo complessivo di azaspiracidi negli animali di cui all'art. 1 (corpo intero o parti consumabili separatamente) e' fissato a 160 µg di equivalente azaspiracido/kg. I metodi d'analisi sono riportati nell'allegato.

Art. 5.

Per il complesso DSP (acido okadaico, dinophysitossine), yessotossine, pectonotossine e azaspiracid nel caso in cui i risultati delle analisi condotte dimostrino discrepanze tra i diversi metodi, il metodo di riferimento e' il test sui topi.

Art. 6.

Il tenore massimo complessivo di ASP (Amnesic Shellfish Poison) nelle parti commestibili degli animali di cui all'art. 1 (corpo intero o parti commestibili separatamente) e' fissato in 20 mg/kg di acido domoico secondo il metodo di analisi HPLC riportato in allegato.

Art. 7.

Il tenore massimo complessivo di veleno paralizzante (PSP) nelle parti commestibili degli animali di cui all'art. 1 (corpo intero o parti consumabili separatamente) e' fissato a 800 microgrammi di equivalente Saxitossina/Kg, utilizzando il metodo di analisi biologico - se del caso associato ad un metodo chimico di ricerca delle saxitossine - o qualsiasi altro metodo riconosciuto secondo la procedura comunitaria. Il metodo di analisi e' riportato in allegato.

In caso di contestazione dei risultati, il metodo di riferimento deve essere il test sul topo.

Il presente decreto e' trasmesso alla Corte dei conti per la registrazione ed entra in vigore il giorno dopo la sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.

Roma, 16 maggio 2002 Il Ministro: Sirchia Registrato alla Corte dei conti il 12 giugno 2002 Ufficio di controllo preventivo sui Ministeri dei servizi alla persona e dei beni culturali, registro n. 3 Salute, foglio n. 314

Allegato METODI DI DETERMINAZIONE Metodi biologici.

Una serie di procedure per il test sui topi, che differiscono nel materiale di prova (epatopancreas o corpo intero) e nei solventi utilizzati per le fasi di estrazione e purificazione, puo' essere utilizzata per la determinazione delle tossine di cui all'art. 1.

Sensibilita' e selettivita' dipendono dalla scelta dei solventi utilizzati per le fasi di estrazione e purificazione e di cio' occorre tenere conto in sede di decisione del metodo da utilizzare al fine di coprire l'intera gamma di tossine.

Un unico test sui topi, che comporta estrazione con acetone, puo' essere utilizzato per individuare acido okadaico, dinophysitossine, pectenotossine e yessotossine. Il test puo' essere, se necessario, completato mediante fasi di separazione liquido/liquido con acetato d'etile/acqua o diclorometano/acqua per eliminare potenziali interferenze. Per l'individuazione di azaspiracidi il test deve essere condotto sul corpo intero.

Per ogni test occorre utilizzare tre topi. La morte di due topi su tre entro 24 ore dall'inoculazione di un estratto equivalente a 5 gr di epatopancreas o 25 gr del corpo intero (in ciascun topo) deve essere considerato un risultato positivo per la presenza di una o piu' tossine di cui all'art. 1 a livelli superiori a quelli fissati dagli articoli 2, 3 e 4.

Il test sul topo condotto con estrazione del materiale di prova con acetone mediante separazione liquido/liquido con etere etilico puo' essere utilizzato per individuare acido okadaico, tossine da dinoflagellate e pectenotossine. Tale metodo non consente la determinazione completa di yessotossine e azaspiracidi in quanto perdite di tali tossine possono verificarsi nella fase di separazione. Per ogni test occorre utilizzare tre topi. La morte di due topi su tre entro 24 ore dall'inoculazione di un estratto equivalente a 5 gr di epatopancreas o 25 gr del corpo intero (in ciascun topo) deve essere considerato un risultato positivo della presenza di acido okadaico, tossine da dinoflagellate e pectenotossine a livelli superiori a quelli di cui all'art. 2.

Il test sui ratti puo' individuare acido okadaico, tossine da dinoflagellate e azaspiracidi. Per ogni test occorre utilizzare tre ratti. Una reazione diarreogena dei tre ratti e' considerata risultato positivo della presenza di acido okadaico, tossine da dinoflagellate e azaspiracidi a livelli superiori a quelli di cui all'art. 2 e all'art. 4.

Metodi alternativi di determinazione.

Una serie di metodi quali la cromatografia liquida ad alto rendimento (HPLC con determinazione fluorimetrica, la cromatografia liquida (LC-spettrometria di massa (MS) immunosaggi, e test funzionali quali il test di inibizione della fosfatasi possono essere utilizzati come metodi alternativi o complementari ai metodi di prova biologici a condizione che, da soli o in combinazione, siano in grado di determinare almeno i seguenti analoghi

acido okadaico e tossine da dinoflagellate: puo' risultare necessaria una fase idrolitica per individuare la presenza di DTX3; pectenotossine: PTX1 e PTX2; yessotossine: YTX, 45 OH YTX, Homo YTX, e 45 OH Homo YTX; azaspiracidi: AZA1, AZA2 e AZA3.

Se vengono scoperti nuovi analoghi che rivestono importanza per la sanita' pubblica, occorre includerli nell'analisi.

Dovranno essere disponibili degli standard ai fini dell'analisi chimica. La tossicita' complessiva e' calcolata avvalendosi di fattori di conversione basati sui dati di tossicita' disponibili per ciascuna tossina.

Le caratteristiche di rendimento di tali metodi devono essere definite e convalidate da un protocollo concordato a livello internazionale.

DETERMINAZIONE DI TOSSINE LIPOSOLUBILI (AOs, DTXs, PTXs, YTXs e AZAs) Protocollo 1.

1. Scopo e applicazione.

   Questa procedura ha lo scopo di determinare le tossine liposolubili AOs, DTXs, PTXs, YTXs e AZAs nei molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini. Il metodo e' semiquantitativo. La quantita' minima di tossina capace di uccidere un topo di 20 g entro le 24 ore, dopo iniezione intraperitoneo, e' definita unita' topo (UT). Questa corrisponde, ad esempio, a circa 4 µg di acido okadaico (AOs) o a circa 3,6 µg di DTX1.

2. Specificita'.

   Il metodo rileva tutte le componenti storicamente incluse nel gruppo delle DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning): acido okadaico ed analoghi (AOs), dinophysitossine (DTXs), pectenotossine (PTXs), yessotossine (YTXs); tossine liposolubili diarroiche identificate recentemente come azaspiracidi (AZAs).

   Sono inoltre rilevate con lo stesso metodo: brevitossine; gymnodimine, spirolidi, pinnatossine, ciguatossine, palytossine, aplysiatossine e lyngyatossine.

   La...